Teicneolaíocht Scannán agus Soiléiriú Vacsaín (Ⅰ)
Tagann vacsaíní ó fhoinsí éagsúla, lena n-áirítear sleachta fíocháin, cealla baictéaracha, cáithníní víreasacha, próitéiní agus aigéid núicléacha a tháirgtear trí chealla athchuingreach mamaigh, giosta agus cealla feithidí.
Tá an modh is coitianta de tháirgeadh vacsaíne bunaithe ar phróiseas coipeadh tosaigh agus íonú ina dhiaidh sin. Is próiseas casta é táirgeadh vacsaíne a bhfuil go leor céimeanna agus próisis éagsúla i gceist leis. Tá sé ríthábhachtach an modh íonúcháin ceart a roghnú chun íonacht an táirge deiridh atá ag teastáil a bhaint amach. Is céim thábhachtach é soiléiriú vacsaíní a bhfuil tionchar suntasach aige ar aisghabháil táirgí agus ar íonú iartheachtach ina dhiaidh sin. Is féidir roinnt teicníochtaí a úsáid chun vacsaíní a shoiléiriú. Braitheann an rogha modh bailiúcháin agus trealamh ar an gcineál ceallraí, nádúr an táirge atá á mbailiú agus an leacht próiseas. Áirítear leis na teicníochtaí seo scagachán membrane (micr-scagadh, scagachán sreafa tadhlaíoch), lártheifneoiriú, agus scagachán domhain (gnáthscagadh sreafa). Ó thaithí fhada, is gnách go ndéantar soiléiriú fómhar vacsaíne trí lártheifneoiriú agus scagachán domhain ina dhiaidh sin.
Le blianta beaga anuas, tá teicníochtaí membrane-bhunaithe tar éis suntas a fháil i soiléiriú vacsaín. Tá próisis in aghaidh an tsrutha ag baint úsáide as teicneolaíochtaí indiúscartha níos mó agus níos mó, agus mar sin ní mór straitéisí fómhair a athrú. Tugann an t-alt seo forbhreathnú cuimsitheach ar theicneolaíochtaí éagsúla atá bunaithe ar membrane agus ar a bhfeidhmeanna maidir le soiléiriú vacsaíne.
01 Réamhrá
Tá vacsaíní ina gcuid ríthábhachtach dár gcosc ar ghalair thógálacha, ar cúis uafásach báis iad fós. Sábháiltear idir 2 agus 3 mhilliún duine ón diftéire, teiteanas, an triuch agus an bhruitíneach gach bliain de bharr imdhíonta. Clúdaíonn vacsaíní raon leathan, ó phróitéiní beaga athchuingeacha go cáithníní víreas iomlána agus baictéir iomlána. Is féidir iad a tháirgeadh trí chórais éagsúla: uibheacha, cealla mamaigh, baictéir, etc. Mar gheall ar chastacht agus éagsúlacht na vacsaíní, níl aon phrótacal nó teimpléad íonú príomhshrutha ann faoi láthair, in ainneoin spéis mhéadaitheach in ardáin vacsaínithe.
De ghnáth, is féidir próiseas vacsaínithe a roinnt ina thrí chuid: in aghaidh an tsrutha (táirgeadh agus soiléiriú), cóireáil anuas (íonú lena n-áirítear ultrafiltration, crómatagrafaíocht, agus cóireáil cheimiceach), agus foirmiú (oibríochtaí líonta deiridh). Neamhspleách ar an gcóras táirgthe, tá ról lárnach ag soiléiriú (substaintí nach dteastaíonn a bhaint ar dtús) maidir le próiseas íonú láidir a chinneadh. Baineann céim shoiléirithe chuí go príomha cealla iomlána, smionagar cille, colloids, agus comhiomláin mhóra chun an t-ualach a bhaineann le próiseáil anuas a laghdú. I gcásanna áirithe, is féidir le soiléiriú neamhíonachtaí dothuaslagtha, próitéiní cille óstach (HCP), agus aigéid núicléacha cille óstach a laghdú freisin. Cosúil le haon chéim íonúcháin eile, ní mór an chéim soiléirithe a bharrfheabhsú chun uastáirgeacht agus íonacht an táirge a bhaint amach agus iad ag oiriúnú do shainiúlacht agus do shrianta táirgeachta na vacsaíne.
Mar gheall ar ilchineálacht cineálacha vacsaíní, úsáidtear teicnící éagsúla le haghaidh soiléirithe, lena n-áirítear lártheifneoiriú nó scagachán (Tábla 1).
Is gnách go mbíonn roinnt sraith oibríochtaí ag teastáil chun an soiléiriú atá ag teastáil a bhaint amach. Tá an chéad oibríocht deartha chun cáithníní níos mó a bhaint (soiléiriú bunscoile) agus tá an dara oibríocht deartha chun colloids agus cáithníní fo-mhiocrón eile a bhaint (soiléiriú tánaisteach). Feidhmíonn lártheifneoiriú íseal-luas mar rogha soiléirithe aonuaire, rud a fhágann gur féidir cealla agus smionagar cille a bhaint le deascadh. Is féidir le lártheifneoiriú ualaí soladacha arda a láimhseáil agus tá sé in úsáid go forleathan i lártheifneoirí baisc nó leanúnacha agus dioscaí. Teastaíonn infheistíocht chaipitiúil agus costais chothabhála arda uaidh, agus tá dúshláin le sárú aige ó thaobh scálú aníos de bharr easpa samhail iontaofa scála síos. Mar sin féin, úsáideann roinnt déantúsóirí vacsaíní tráchtála lártheifneoirí i dtáirgeadh ar scála mór a bhaineann le líon ard próiseála agus níos mó gníomhaíochtaí táirgthe.
Is féidir scagachán soiléirithe a dhéanamh trí scagachán gnáthshreafa (NFF, ar a dtugtar scagachán deireadh marbh) nó scagachán sreabhadh tadhlaíoch (TFF, ar a dtugtar scagachán tras-sreafa freisin). Tá modhanna scagaire sonracha ann freisin (scagairí domhain) ina bhfuil ábhair a ghearrtar go dearfach agus SEIF scagaire a chuireann feabhas ar choinneáil smionagar cille, colloids, agus comhpháirteanna nach dteastaíonn a mhuirearú go diúltach.
Coinníonn scagairí membrane cáithníní de réir méid eisiamh agus níl cumas coinneála salachar ard acu, agus mar sin tá siad oiriúnach le haghaidh céimeanna soiléirithe tánaisteacha. Tá scagairí domhain agus scagairí membrane araon éasca le scála agus le cur i bhfeidhm (dearadh córas simplí). Murab ionann agus NFF, úsáidtear TFF go príomha le haghaidh soiléirithe bunscoile (micrea-scagadh). D'éirigh le membrane le raon scoite de 0.1-0.65 μm (b'fhearr le cainéal oscailte) a úsáid chun cealla, smionagar cille agus ábhar salaithe mór eile a choinneáil. Tá an chuid is mó de threalamh TFF inscálaithe líneach agus in-athúsáidte tar éis a ghlanadh, rud a laghdaíonn go mór costas na n-earraí inchaite don chéim.
Luíonn an chéim soiléirithe idir na próisis in aghaidh an tsrutha agus iartheachtacha agus uaireanta déantar neamhaird de le linn fhorbairt an phróisis vacsaínithe toisc go dtugtar tús áite d’am agus d’acmhainní do chéimeanna íonúcháin eile, amhail crómatagrafaíocht nó lártheifneoiriú grádáin dlúis.
Is minic a fhágann paitinní do phróisis déantúsaíochta vacsaíní an chéim soiléirithe ar lár fiú. Bíonn tionchar díreach ag an éifeachtúlacht soiléirithe ar fheidhmíocht an phróisis anuas. Is féidir le céim soiléirithe droch-uasmhéadaithe tionchar diúltach a imirt ar chumas an scagaire steiriliú nó féadfaidh sé saol seirbhíse an roisín crómatagrafaíochta a ghiorrú. Sa lá atá inniu ann, tá claonadh ag ionchais rialála níos déine a chur ar mhonaróirí vacsaíní vacsaíní níos íona, dea-thréithe ach inacmhainne a tháirgeadh. Sa chás seo, ní mór an aird atá tuillte aige a thabhairt do gach céim. Tugann treochtaí reatha le fios go bhfuil an próiseas in aghaidh an tsrutha ag bogadh i dtreo córas slonn "níos glaine" (ie cuireann cealla saothraithe i meáin saor ó serum in ionad uibheacha) le táirgiúlacht mhéadaithe agus dlús cille níos airde.
Tá próisis íonúcháin iartheachtacha á simpliú agus á sruthlíniú chun íonacht an táirge deiridh a mhéadú. Chun na hathruithe seo a láimhseáil, ní féidir le céim an soiléirithe a bheith ina bac. Sa chás seo, comhlíonann teicneolaíocht scagacháin dúshlán soiléirithe nua, ag tabhairt aghaidh ar na saincheisteanna a bhaineann le solúbthacht próiseas méadaithe, féidearthacht aonúsáide, agus costais infheistíochta laghdaithe.
02 Soiléiriú ar vacsaíní víreas
Baineadh úsáid go rathúil as roinnt cineálacha modhanna soiléirithe, ina n-aonar nó i dteannta a chéile, chun an fómhar ag deireadh beatha na vacsaíní a shoiléiriú.
Scála píolótach :1-20L, scála táirgeachta: níos mó ná 20L
2.1 Réamhchúraimí maidir le soiléiriú vacsaíne víreas
Bíonn na cáithníní víreas go léir nó cuid de sna vacsaíní chun díolúine a chruthú in aghaidh ionfhabhtú víreasach. Go ginearálta baineann siad le ceithre chatagóir leathana:
Vacsaín bheo mhaolaithe (LAV), atá bunaithe ar bhrú lagaithe den víreas chun a ghanntanas a laghdú. Is féidir le víris mhaolaithe a mhacasamhlú sa chorp ach níl siad pataigineach.
- Vacsaín víreas neamhghníomhaithe (IV), ina bhfuil víris neamhghníomhaithe go ceimiceach nó ultraivialait chun ionfhabhtaíocht a dhíchur. Is féidir le cáithníní víreas a bheith iomlán, roinnte, nó íonaithe (próitéiní antaigineacha amháin).
- Is víreas gníomhach, neamhphataigineach é an vacsaín veicteoir víreasach (VV) a chuireann antigen víreas pataigineach i láthair. Úsáidtear na struchtúir seo a forbraíodh le déanaí freisin le haghaidh feidhmeanna géinteiripe.
Vacsaíní cosúil le víreas (VLPanna), aicme ar leith de vacsaíní fo-aonaid víreasacha a dhéanann aithris ar struchtúr iomlán na gcáithníní víreasacha ach nach bhfuil ábhar géiniteach ionfhabhtaíoch iontu.
I bhformhór na gcásanna, tá na cáithníní víreasacha slán go hiomlán le linn na céime soiléirithe, fiú le linn lysis an vacsaín víreasach (de ghnáth déantar scoilteacht le sruth, i dtimpeallacht níos íonaithe).
Is é an príomhdhúshlán a bhaineann le soiléiriú víreasach ná cáithníní víreasacha ard-toraidh a aisghabháil agus smionagar cille, comhiomláin mhóra agus ábhair shalaithe dothuaslagtha a bhaint go héifeachtach. Mar a thuairiscítear sna hailt seo a leanas, tá roinnt fachtóirí ann a d’fhéadfadh díghrádú nó caillteanas víreas a bheith ann. Ina theannta sin, is féidir a bheith deacair brath ar tháirgeacht víreasach mar gheall ar an éagsúlacht ard de mhodhanna measúnaithe cainníochtúla víreasacha ag an gcéim seo den phróiseas, go háirithe le haghaidh vacsaíní LAV agus VV. Maidir leis na vacsaíní seo, is minic a dhéantar meastóireacht ar tháirgeacht víreasach trí úsáid a bhaint as tástálacha ionfhabhtaíochta amhail an tástáil plaic nó tástáil TCID 50. Méadaíonn an fhíric go bhféadfadh cuid de na comhdhúile a bhaintear cur isteach ar chumas an víris cealla táscacha a ionfhabhtú, éagsúlacht an chur chuige cainníochtúil seo.
2.2 Straitéis soiléirithe vacsaíne víreas
Athraíonn vacsaíní víreasacha go mór i méid, struchtúr, cruth, agus córais slonn (Tábla 3).
Mar thoradh air sin, go ginearálta níl aon teimpléad ann dá phróisis iartheachtacha, go háirithe na céimeanna soiléirithe. Go teoiriciúil, is féidir na teicnící go léir atá ar fáil (lártheifneoiriú íseal-luas, microfiltration TFF, NFF) a roghnú agus a chomhcheangal chun an víreas a shoiléiriú. Go deimhin, bíonn tionchar ag rath na modhanna soiléirithe ar an gcóras léirithe agus ar airíonna fisiciceimiceacha na víris atá i gceist.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} cealla /ml) modh soiléirithe, ag baint úsáide as polaiméirí cationic, laghdú ar an limistéar scagacháin domhain faoi 4 huaire i gcomparáid le modhanna traidisiúnta. Ceadaíonn an teicníocht seo do choiptheoirí mórchumais a bhaint gan lártheifneoirí a úsáid. Ar an gcaoi chéanna, tá Riske et al. léirigh cóireáil chitosan ar chultúir 40 L cille (0.02%) ina raibh 1.4-2.6% de sholaid gur tháinig méadú 7-faoi dhó ar an toilleadh iomlán scagaire tar éis scagachán domhain.
Luann siad freisin gur dealraitheach go bhfeabhsaítear éifeachtúlacht soiléirithe chitosan trí cháithníní submicron a flocasú, a shocraíonn go hiondúil i lártheifneoirí. Is dócha go leanfaidh modhanna réamhchóireála agus flocasúcháin de bheith mar chuid de shoiléirithe scagacháin vacsaíne amach anseo. Is fearr le penetrants, lena n-áirítear siúcraí, gliocóil, agus aimínaigéid, víris flocasacha. Is féidir flocasúchán víreasach le tuaslagán osmotic agus 0.2µ micrea-scagachán ina dhiaidh sin a úsáid mar phróiseas cuimsitheach le haghaidh íonú víreas. Is féidir le penetrants comhiomlánú víreasach a spreagadh tríd an gciseal hiodráitithe timpeall na gcáithníní a laghdú chun cáithníní víreas neamh-ionchochlaithe hidreafóbach agus cáithníní víreas ionchochlaithe a flocasú. Cé gur léiríodh go bhfuil víris flocasacha ag penetrants, tá an cumas ag an modh a bheith ina ardán le haghaidh íonú vacsaíní sa todhchaí, agus níl a indéanta i íonú vacsaínithe píolótach nó ar scála mór cruthaithe. Déantar an modh pretreatment flocasúchán, is dócha go leanfaidh sé de bheith mar chuid de shoiléiriú scagaire vacsaín sa todhchaí, i gcoiptheoir 2L. Chun go bhféadfaí iad a úsáid in oibríochtaí táirgthe ar mhórscála, ní mór na modhanna seo a bhailíochtú ar scálaí píolótacha agus táirgthe.
2.2.1 Tionchar córais a léiriú
Braitheann an modh soiléirithe go príomha ar an gcineál próiseas in aghaidh an tsrutha agus córas léirithe, a chinneann cineál agus leibhéal na n-éillithe atá le baint. Is iondúil go dtáirgtear vacsaíní víreasacha i suthanna sicín trí línte cille leanúnacha mamaigh nó éan nó bacúlivíreas/cealla feithidí, ar córas cainte níos casta iad. D’fhéadfadh roinnt cineálacha VLPanna a bheith á dtáirgeadh ag córais heitreolaíochta eile léirithe (baictéir, giosta, cealla plandaí).
2.2.1.1 Víreas a tháirgtear i suth sicín
Táirgtear vacsaíní in uibheacha le blianta fada anuas. Téann an obair seo siar go dtí 1931, nuair a d’éirigh le Woodruff agus Good Pasture an membrane chorio-allatoic d’uibheacha torthúla mar fhoshraith d’fhás víreasach. Sa lá atá inniu ann, táirgtear go leor vacsaíní daonna agus tréidliachta fós ag baint úsáide as an bpróiseas ársa seo. Is dócha gurb é an vacsaín don fhliú séasúrach an ceann is fearr aithne. Is é an prionsabal ná uibheacha sicín a ionaclú le víris leasa agus ansin iad a mhacasamhlú sa membrane chorio-allantoic. Tar éis atáirgeadh, bailítear agus íonaítear sreabhach allanotoic atá saibhir i gcáithníní víreasacha.
Is beatha shoiléir dhúshlánach é sreabhach alantoic. Tugann a ard-ábhar mianraí agus próitéin (lena n-áirítear ubhalbaimin) slaodacht ard dó. Tá comhdhúile fíocháin riachtanacha ó shuthanna sicín i sreabhán alantóideach freisin, mar shampla cleití, gob, soithigh fola nó cealla fola. Mar gheall ar an ardchion solad, is é lártheifneoiriú ísealluais an rogha is fearr le haghaidh soiléirithe príomhúil, agus de ghnáth bíonn ráta aisghabhála de thart ar 70% mar thoradh air. Mar sin féin, is féidir freisin soiléiriú bunscoile ag baint úsáide as teicnící scagacháin. I gcás NFF, tá dea-chumas bailithe sreabhán allantoic ag scagairí domhain polapróipiléine agus ceallalóis. Is féidir le scagairí dromchla atá déanta as polapróipiléine nó scagairí domhain ceallalóis cumas de 150-210 L/m² a bheith acu agus moirtiúlacht an tsreafa beatha a laghdú suas le 3 huaire. Tá an gléas TFF cainéal beatha oscailte oiriúnach freisin do shoiléiriú sreabhán allantoic, toisc go bhfuil an gléas níos oiriúnaí do chaillteanas brú íosta tríd an gcainéal beathaithe, rud a laghdóidh bac an chainéil.
Is féidir an chéim thánaisteach soiléirithe a dhéanamh go héasca le NFF. Léiríonn meascán d'ábhair polapróipiléine, ceallalóis agus snáithíní gloine dea-éifeachtúlacht go ginearálta, agus is é rogha eile an chéim soiléirithe tánaisteach ná TFF agus gléas membrane microfiltration {{0}.65μm nó 0.45μm a úsáid agus flux osmotic a oibriú. smacht. Is féidir gléas TFF cainéal oscailte le PVDF hydrophilic nó membrane hydrophilic PES a úsáid sa chéim seo.
Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go bhféadfadh cáithníní víreasacha a bheith bainteach le hábhar smionagar dothuaslagtha, rud a d'fhéadfadh laghdú suntasach a dhéanamh ar tháirgeadh víreasach le linn soiléirithe. Is féidir úsáid a bhaint as tuaslagán salainn an comhlachas seo idir víris fliú agus blúirí soladacha a laghdú, rud a fhágann go dtiocfaidh méadú thart ar dhá uair ar tháirgeadh gan cur isteach ar shláine na gcáithníní víreasacha.
2.2.1.2 Víris a tháirgtear i línte cille mamaigh agus éanlaithe i ndiaidh a chéile
Le déanaí, tá roinnt vacsaíní víreasacha tar éis bogadh ar shiúl ó phróisis uibheacha-bhunaithe i bhfabhar próisis atá bunaithe ar chultúr cille (go háirithe le haghaidh vacsaíní fliú). Is í an phríomhchúis leis an athrú seo ná cosc a chur ar fhadhbanna táirgthe vacsaíne a bhaineann le huibheacha suthanna (ie ganntanas soláthair uibheacha a d’fhéadfadh tarlú i gcás ráig galair éanlaithe clóis). Mar thoradh air sin, déantar go leor cineálacha vacsaíní agus veicteoirí víreasacha a fhorbairt faoi láthair ag baint úsáide as línte cille leanúnach ó mhamaigh nó éin, línte cille traidisiúnta (cosúil le línte cille Vero, MDCK, nó HEK293), nó línte cille dílseánaigh.
Ag brath ar an gcóras slonn, féadfaidh an víreas fanacht taobh istigh den chill, a éilíonn céim lysis cille, nó féadfaidh sé fanacht lasmuigh den chill (lysis nó óga). Tá an t-ualach soladach agus an t-ábhar intuaslagtha a fhaightear ó chultúr na gcealla i bhfad níos glaine ná an chéim leachtach allantoic. Mar thoradh air sin, tá teicneolaíocht NFF níos éasca a chur i bhfeidhm agus tá an cumas i bhfad níos airde. Mar sin féin, tá an cumas scagacháin ag brath go mór ar choinníollacha cultúir na gceall, amhail dlús cille nó inmharthanacht cille ag an bhfómhar. Bíonn tionchar ag na paraiméadair seo ar an méid smionagar cille agus macro-chomhiomláin a fhéadfaidh scagairí agus seicní domhain a chlog, rud a fhágann go bhfuil cumas laghdaithe ann.
Tugann Thomassen et al sampla maith de shoiléiriú NFF. Úsáidtear é i bpróiseas táirgthe poliovirus neamhghníomhaithe (IPV). Baineadh úsáid as cealla vero saothraithe ar mhicrea-iompróirí le haghaidh iomadú víreasach le dlús cille de {{{0}}.78 x 106 cealla /ml TOI. Úsáidtear scáileán cruach dhosmálta 75μm le haghaidh réamh-shoiléirithe chun microcarriers a bhaint as an fómhar. Soiléirítear an grádú ciseal dúbailte trí úsáid a bhaint as scagaire domhain dlúis (0.2-2.0μm), agus scagaire grád aimridithe ina dhiaidh sin.
Úsáideadh an t-aonad inscálaithe roghnaithe go rathúil chun ábhar trialach cliniciúil Sabin IPV a ullmhú ar scála 350 L. Ag brath ar shéiritíopa an víris, faightear ráta aisghabhála víreas de 86 go 96 faoin gcéad.
2.2.1.3 Baculovirus/cáithníní cosúil le víreas a tháirgtear i gcóras cille feithidí
Is rud réasúnta nua é córais bacúlaivíris/chealla feithidí a mheas le haghaidh táirgeadh vacsaíne ar scála mór, ach tá sé ag tarraingt níos mó spéise i réimse na veicteoirí víreasacha agus VLPanna. Is é príomhbhuntáiste an chórais seo ná go mbaineann sé le táirgeadh gearrshaolach (ní gá línte cille a bhunú) agus sábháilte (gan aon DNA víreasach iomlán). Tá roinnt míbhuntáistí ann freisin, mar shampla an gá atá le baint baculovirus agus cobhsaíocht táirgí.
Is é Cervarix, vacsaín VLP i gcoinne ionfhabhtú papillomavirus daonna arna dtáirgeadh ag GlaxoSmithKline, an chéad vacsaín daonna a tháirgtear go tráchtála i gcealla feithidí. Tá roinnt vacsaíní bunaithe ar VLPanna agus veicteoirí rAAV a tháirgtear i gcealla feithidí a bhfuil ionfhabhtú bacúilivíris orthu á bhforbairt faoi láthair. Is iad línte cille feithidí a dhíorthaítear ó phéist arm an fhómhair Spodoptera frugiperda (Sf9 agus Sf21) agus péitse cabáiste Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4) na cinn is coitianta a úsáidtear mar gheall ar a gcumas fás i bhfionraí, rud a shimplíonn aimpliú an tsrutha. próiseas. Tar éis fás go dtí an dlús cealla beo atá ag teastáil, tá na cealla seo ionfhabhtaithe le baculovirus athchuingreach sa chéim fáis easpónantúil cille le haghaidh léiriú próitéine. Ceadaíonn genome mór baculoviruses cúig phróitéin éagsúla nó níos mó a léiriú, a mheaitseálann castacht VLP agus veicteoirí víreasacha.
Bhí Bernard et al. cur síos ar an bpróiseas le sruth de chultúr na gceall feithidí. Tá an próiseas an-athraitheach, rud a léiríonn éagsúlacht na bpróitéiní a tháirgtear leis an teicníc seo. Tá an chéad chéim den seicheamh íonúcháin faoi thionchar saintréithe toirte an bhithimoibreora (ie, dlús cille agus inmharthanacht), nó nádúr scaoileadh an táirge (faoi rún ag lysis óga nó cille). Is féidir le hionfhabhtú baculovirus i gcealla feithidí a bheith ina chúis le lysis cille laistigh de 3-5 lá. D'fhéadfadh méadú ar ghníomhaíocht próitéalaíocha agus fachtóirí comhshaoil eile a bheith mar thoradh ar scriosadh cealla a d'fhéadfadh díghrádú próitéiní athchuingreach a bheith mar thoradh air.
Rinneadh iarrachtaí baculoviruses a fhorbairt a bhfuil cumas níos ísle acu lysis cille a thionscnamh. Lyses an baculovirus níos lú ná 10 faoin gcéad de na feithidí ionfhabhtaithe.
Is féidir lysis cille a dhéanamh ag baint úsáide as modhanna éagsúla, mar shampla reo-leá, glantaigh, homogenizers, nó cóireáil ultrafhuaime. Níl aon bhalla cille ag cealla feithidí agus dá bhrí sin tuaslagann siad go tapa. Cé gur tuairiscíodh cóireáil ultrasonaic i go leor próisis binse, is annamh a úsáidtear é ar scála turgnamhach nó tráchtála. Is é an modh is coitianta ná homogenizer a úsáid chun cealla a scriosadh i láthair glantach tiúchan íseal (0.1% Triton X-100 nó NP-40). Baineadh úsáid as glantach agus microfluidization nó homogenization tionchar osmotic go rathúil i go leor próisis déantúsaíochta ar scála mór. Go hiondúil, cuirtear cealla feithidí ar fionraí i maoláin lysis (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% gliocról, 0.2 mM PMSF, agus coscairí protease), lena linn sin Triton-X100 a chuirtear le tiúchan deiridh de 0.1%, agus ultrafhuaime éadrom nó microfluidization ina dhiaidh sin. Déantar an meascán a lártheifneoiriú ansin chun cáithníní dothuaslagtha a bhaint.
Ag an gcéim seo, d'fhéadfadh cuma an-scamallach a bheith ar an lysate agus tá sé deacair é a scagadh le scagaire 0.45μm. Uaireanta is féidir caillteanais suas le 30% a thabhairt faoi deara le linn na céime soiléirithe pirealaithe. Cuidíonn cur leis na benzoenzymes ag an gcéim scoilteachta chun an fhadhb scagacháin a réiteach. Trí na cealla a ghlanadh le sáile maolánach fosfáit tar éis an fhómhair agus "reo-leá" tapa i salann ard (500mM NaCl) ina bhfuil an maolán scoilte cabhraíonn sé leis na comhiomláin a bhaint.
Tarlaíonn soiléiriú VLPanna agus veicteoirí víreasacha arna dtáirgeadh ag cealla feithidí tar éis lysis cille (trí chóireáil cheimiceach nó meicniúil), a scaoileann ní hamháin cáithníní víreasacha ach freisin méideanna móra aigéad núicléasach ceallacha. Tá cealla feithidí in ann fás ag dlús cille ard, ó 1-9.10 6 cealla/ml. Dá bhrí sin, ba cheart go ndéileálfadh an chéim soiléirithe le dlús cille ard, ábhar ard aigéid núicléacha agus, más féidir, cáithníní baculovirus a bhaint. Chun cúrsaí a dhéanamh níos casta, is féidir méideanna comhchosúla a bheith ag VLPanna nó ag veicteoirí víreasacha agus baculoviruses (bíonn baculoviruses 60-80 nanaiméadar ar leithead agus 300-400 nanaiméadar ar fad). Mar gheall ar dhlús ard na gceall, is é lártheifneoiriú an teicníocht is fearr le haghaidh soiléirithe príomhúil le blianta fada anuas. Mar sin féin, is cosúil go bhfuil próisis membrane ina rogha eile an-tarraingteach toisc go bhfuil sé éasca scalability a shainiú.
Baineadh úsáid éifeachtach as scagairí domhain sa phróiseas le sruth de cháithníní trí chiseal atá cosúil le rótaivíris. Ag an leibhéal saotharlainne, is minic a úsáidtear an modh ultracentrifugation grádán dlús CsCl chun na cáithníní casta seo a íonú. Rinne na taighdeoirí measúnú, ní hamháin ar chéim soiléirithe an scagaire domhain, ach freisin ar an bpróiseas le sruth ar fad (triton X-100 scoilteachta agus scagachán domhain, agus ina dhiaidh sin ultrascagadh agus eisiamh méid na gcáithníní). Léiríonn na torthaí gur féidir le táirgeacht grádán dlúis CsCl 37% a bhaint amach.
Tá an modh ultra-lártheifeach thart ar 10%. Mar shampla eile, baineadh úsáid as snáithíní log 0.45μm agus 500 kDa snáithíní trastomhais fíneáil chun cáithníní cosúil le VEID a tháirgtear i gcealla feithidí a aisghabháil agus a chomhchruinniú. Sa staidéar seo, rinneadh fórsa lomadh na snáithíní log a bharrfheabhsú bunaithe ar shláine cille. Torthaí Bunaíodh próiseas fórsa lomadh íseal chun ultralártheifneoiriú grádán siúcra boird a athsholáthar.
Tá an cumas ag an bpróiseas a chur i bhfeidhm ar olltáirgeadh. Baineadh úsáid rathúil freisin as scagairí domhain chun víris athchuingeacha a bhaineann le adenóis a tháirgeadh. Rinneadh lysis cille le suanbhruith cille meicniúil dhá loine, agus cóireáil núicléas ina dhiaidh sin. Sa chéim soiléirithe, baineadh úsáid as eilimint scagaire domhain snáithín gloine 1.2μm, agus ina dhiaidh sin dhá shraith de 0.8μm hydrophilic PES agus 0.2μm hydrophilic PES. Úsáidtear scagairí ar mhéid comhréireach le haghaidh baisceanna próisis ó mhéideanna níos lú go dtí 2 mhéid L. Baineadh úsáid rathúil as scagairí domhain, agus tuairiscíodh freisin go bhfuil rátálacha TFF le scannáin chothroma nó snáithíní cuas 0.2µm nó 0.45µm an-éifeachtach.
Bhain an staidéar a rinne Tecnologica (IBET) ag Institiúid Bitheolaíochta Turgnamhach Oeiras sa Phortaingéil úsáid as NFF chun soiléiriú a dhéanamh ar heipitíteas C VLP arna chur in iúl ag baculoviruses gan lártheifneoiriú. Úsáidtear scagairí polapróipiléine rátáilte ainmniúil (10,5,0.6 agus 0.3μm) chun baint VLP a shoiléiriú. Úsáidtear na scagairí céanna le rátálacha pore 0.6μm agus 0.3μm le haghaidh scagacháin in ionaid bhuainte VLP. Rinneadh tástáil ar na scagairí go léir a ndearnadh staidéar orthu le haghaidh rátaí aisghabhála HCV-VLP agus rinneadh comparáid idir na modhanna scagacháin molta. Tá na torthaí léirithe i dTábla 4.
Léiríodh sna torthaí go raibh an t-aisghabháil táirge ab airde (100%) ag an scagaire 5μm-0.3μm maidir le beathú VLP heipitíteas C a lománaíodh go díreach. Bhí an t-aisghabháil táirge is airde (82%) ag an scagaire polapróipiléine 0.6μm don bheathú lárnach, agus bhí imréiteach DNA na cille óstach thart ar 70%.
2.2.1.4 Cáithníní cosúil le víreas a tháirgtear i gcórais bhaictéarach nó giosta
Braitheann an cineál modh soiléirithe do vacsaíní VLP a chuirtear in iúl i gcórais baictéarach nó giosta ar scaoileadh VLP chuig idirghabhálaithe seachcheallacha. Mura féidir VLPanna a scaoileadh go héifeachtach, d'fhéadfadh go mbeadh gá le lysis cille nó céimeanna eastósctha eile roimh chéim an soiléirithe iarbhír. Cé gurb é seo an caighdeán óir sa tionscal soiléirithe próitéine, lártheifneoiriú (leanúnach nó bhaisc) arna chur in iúl i gcórais baictéarach nó giosta-bhunaithe, le déanaí, tá próisis membrane tar éis éirí ina rogha eile an-tarraingteach mar gheall ar a n-éascaíocht inscálaithe agus comhoiriúnacht le húsáid aonair. cóireálacha.
Míníonn Richter agus Topell úsáid lártheifneoirithe, TFF, nó teaglaim den dá cheann agus VLPanna a tháirgtear in E. coli soiléirithe á n-ullmhú. Ina gcuid oibre, úsáideadh 0.45m seicní TFF chun na homaiginí E. coli homogenized a chaolú agus a shoiléiriú ag teocht 5 céim . Tugann siad faoi deara freisin go bhfuil TFF membrane-bhunaithe oiriúnach chun fómhar ard-slaodachta a láimhseáil, agus b'fhearr úsáid a bhaint as aonaid TFF le cumraíochtaí cainéil oscailte.
Rinneadh measúnú freisin ar shoiléiriú lártheifeacha mar mhalairt ar TFF. Sa chás seo, níor caolaíodh an aonchineálach a bhí mar thoradh air agus níor rinneadh é a lártheifneoiriú ag 4 chéim ar feadh 105 nóiméad, 10000g. Gan an sciath bog a aistriú, doirteadh an súthach as na cáithníní agus ath-lártheifneoiriú ag 4 céim agus 10,000 g ar feadh 60 nóiméad. Baineadh an comhshnámh ansin de na cáithníní láithreacha, caolaíodh é le maolán EB (43.89 mM Tris HCl, 6.11 mM Tris Base, 5.0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2, agus scagtha ar ghléas scagaire steiriúil 0.22 m. Tuilleadh próiseála. Tuairiscíodh freisin gur soiléiríodh an próiseas méadaithe chun an vacsaín VLP seo a tháirgeadh in E. coli ar scála 800L trí lártheifneoiriú agus TFF a chomhcheangal.
Tá an vacsaín heipitíteas athchuingreach E HEV 239 ceadúnaithe sa tSín chun daoine fásta 16 bliana d'aois agus níos sine a imdhíonadh. Cuirtear antaiginí vacsaíne (VLP) in iúl in E. coli, agus tá sé léirithe go bhfuil méadú ar an bpróiseas táirgthe antaiginí ar scála 50L. Baineadh an táirge trí scoilteadh E. coli agus rinneadh na comhlachtaí cuimsithe a scaradh ó na blúirí cille trí níochán trom le maolán ina raibh 2% Triton X-100 agus ansin díscaoileadh le homogenizer úiré 4 M. Soiléiríonn TFF an víreas papilloma daonna VLP a tháirgtear i Saccharomyces cerevisiae (15L). Soiléiríodh an lysate cille cóireáilte le nuclease ag microfiltration tras-sreabhadh i mód tras-scagtha ag baint úsáide as 0.65 μm scagaire snáithín log. Úsáidtear an próiseas céanna i dtáirgeadh vacsaíní. Cé nach bhfuil ach dornán vacsaíní VLP-bhunaithe bainte amach ar scála tráchtála, tá roinnt vacsaíní VLP-bhunaithe á bhforbairt, agus déantar an chuid is mó díobh a shoiléiriú trí úsáid a bhaint as teicneolaíocht lártheifneoirithe nó membrane.
Teoranta ag tionchar an spáis, roinnfimid an dara leath den ábhar sa chéad chaibidil eile. Sa chéad alt eile, déanfaimid roinnt cásanna de shoiléiriú vacsaín agus úsáid comhpháirteanna membrane ábhartha.
Mar an chéad chuideachta sa chiorcad logánaithe, tá go leor taithí ábhartha carntha ag Guidling Technology ar shoiléiriú vacsaíní. Is cuideachta forbartha agus táirgthe é Guidling Technology a dhíríonn ar chultúr bithchógaisíochta agus cille, íonú agus scaradh. Úsáidtear táirgí go forleathan i bpróiseas bithleighis, diagnóis, scagachán sreabhán tionsclaíoch, braite, soiléiriú, íonú agus tiúchan; D'éirigh le Guidling feadán lártheifneoir ultra-scagacháin, caiséad membrane ultra-scagacháin / micrea-scagadh, scagaire a bhaint víreas, gléas scagaire sreabhadh tadhlaíoch, stack membrane domhain, etc., a chomhlíonann go hiomlán na cásanna iarratais maidir le cultúr bithchógaisíochta agus cille.
Úsáidtear ár seicní agus ár scagairí membrane go forleathan i dtiúchan, eastóscadh agus scaradh réamhscagtha, microfiltration, ultrafiltration agus nanofiltration. Is féidir lenár raon leathan línte táirge, ó scagachán saotharlainne aon-úsáide beag go córais scagacháin de chineál táirgthe, tástáil steiriúlachta, coipeadh, cultúr cille agus níos mó, freastal ar riachtanais tástála agus táirgthe.
